什么是高效液相色谱法？

 HPLC（高效液相色谱）是一种利用色谱柱和样品之间的相互作用来分离和检测样品中所含每种化合物的方法。由于它易于测量并且可以检测痕量成分，因此被应用于多种行业，包括制药、生物化学、食品和环境。

另外，由于HPLC的峰面积与样品浓度成正比关系，因此还可以定量样品中所含成分的浓度。请注意，HPLC 中样品的分离行为因色谱柱和流动相而异，因此需要设计适当的分析条件。

如何使用和使用高效液相色谱法

HPLC（高效液相色谱）是一种利用色谱柱和样品之间的相互作用来分离样品中各成分的分析方法。使用非常方便，直接注入样品溶液或将样品溶液放入自动进样器中进行批量处理即可进行分析。

HPLC 用于各个行业。例如，在制药领域，用于分析微量杂质和活性成分；在食品、饮料、环境领域，用于分析营养成分、功能成分、添加剂、残留农药；在生物化学、用于分析蛋白质和核酸相关物质 用于分析物质。

HPLC 原理和所用色谱柱

HPLC 和气相色谱 (GC) 是色谱法的类型。色谱法是使分析对象物中含有的各化合物一边被吸附一边通过色谱柱，根据各成分的吸附力的差异进行分离的方法。样品成​​分流动的介质（例如 HPLC 溶剂和 GC 气体）称为“流动相”，而吸附样品的材料（例如色谱柱）称为“固定相”。
样品和色谱柱中所含组分之间相互作用的类型和程度根据色谱柱的类型而有所不同。例如，ODS 柱用烷基链（十八烷基）修饰，通过疏水相互作用吸附样品。

另一方面，在硅胶柱中，表面的硅烷醇基团吸附极性化合物。此外，还有苯基、氰基、氨基修饰的色谱柱。

使用 HPLC 峰面积计算浓度

HPLC 峰面积与样品浓度成正比。然而，使用紫外检测器时，即使样品浓度相同，峰面积也会根据消光系数（吸收光的容易程度）而变化。因此，使用HPLC进行浓度分析时，需要准备标准物质来比较面积。

浓度分析的一种方法是“外标法”。在该方法中，制备多个已知浓度的标准样品，并进行 HPLC 分析以确定峰面积。由于每个样品的浓度是已知的，通过绘制面积值和浓度，可以获得根据面积值计算浓度的公式。

第二种方法是“内标法”。在此方法中，将另一种化学和物理稳定的化合物作为内标添加到已知浓度的标准样品中。添加后，进行HPLC分析，测定标准样品与内标物的峰面积之比。横轴为内标物质的添加比例，纵轴为峰面积比，由此可以求出校准曲线。

HPLC 检测器和检测限

各种设备作为 HPLC 检测器出售。示例包括紫外-可见光谱 (UV-Vis) 检测器、荧光检测器和示差折光检测器 (RID)。这些检测器的检测限根据样品的不同而有很大差异。例如，UV-Vis 检测器的检测限约为 10 皮克 (pg)，荧光检测器的检测限约为 0.1 pg。

最灵敏的方法是质谱仪(MS)，估计其检测灵敏度为 0.01 pg。然而，检测限取决于样品中所含化合物的类型和浓度以及分离程度。在某些情况下，可能还需要通过向样品添加发射荧光的官能团来“衍生”样品。如果想要进行高灵敏度的检测，就需要优化HPLC分析，包括样品前处理。